Essent.press

Что такое ПЦР-тест и как его настроить? Доводы биофизика

Хоакин Соролья. Научное исследование. 1897
Хоакин Соролья. Научное исследование. 1897

Прошедшие 2 года глубоко отпечатались в сознании народов России и всего мира в связи со странной внезапно появившейся заразой COVID-19. Мы надеемся, что беспрецедентные меры по защите населения, принятые главами регионов в России, основывались на многофакторной оценке ситуации с вирусом. Сегодня мы поговорим о ключевом инструменте получения информации по масштабам заражения, а значит и важной опоре в принятии решений оперативными штабами по коронавирусу. Таким инструментом является ПЦР-тест.

Свои вопросы о ПЦР-тестах, какие они бывают, и что они выдают в качестве результата, а также о тонкостях их настройки мы задали Артему Валерьевичу Трилису, кандидату физико-математических наук, специалисту в области биофизики.

Артем Трилис: Я закончил физический факультет Новосибирского государственного университета, первая моя специальность — биомедицинская физика. Планировал работать в ГНЦ «Вектор», но судьба сложилась так, что я защитил кандидатскую диссертацию по специальности «Механика жидкости, газа и плазмы» и работаю в этой области. Полученное в ВУЗе образование в области биомедицинской физики позволяет мне успешно разбираться в аспектах молекулярной биологии и вирусологии.

ИА Красная Весна: Поскольку Вы понимаете медицину на физическом уровне, расскажите пожалуйста, что такое ПЦР-тест, хорош он или плох для оценки состояния здоровья человека?

Артем Трилис: ПЦР — это полимеразная цепная реакция.

Это реакция, в которой полимераза (фермент, сложная молекула) производит полимеры, состоящие из нуклеиновых кислот. Например, ферменты ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы производят молекулы ДНК и РНК соответственно, преимущественно, путем копирования исходных родительских цепей ДНК или РНК.

Один из отцов молекулярной биологии Артур Корнберг открыл этот эффект для фермента ДНК-полимеразы, который из молекулы-цепочки ДНК делает еще одну цепочку — ДНК-копию. В смесь (субстрат) из органических цепочек молекул (нуклеотидов) и исходную ДНК (ДНК-матрицы) он добавлял ДНК-полимеразу и обнаружил, что она создает копии ДНК по имеющейся матрице пока не закончится субстрат для приготовления этих копий. Это оказалось очень эффективным методом научных исследований в молекулярной биологии, микробиологии, вирусологии.

Когда нам нужно найти какой-то вирус (агент), мы добавляем ДНК-полимеразу в жидкости, содержащие генетические материалы чего-либо, и она нам плодит копии, многократно увеличивая их концентрацию в жидкости. Если там была одна молекула, то их станет несколько и их можно будет увидеть на электрофорезе.

Электрофорез — это такой метод исследования, когда к копиям молекул добавляется специальный гель, прикладывается электрическое напряжение и по дальтонам (молекулярной массе) эти копии расслаиваются, создавая затемнения — полоски. И с помощью калибровки можно понять, где 20, 30 дальтон и т. д. Т. е. можно восстановить нуклеотидную последовательность.

ИА Красная Весна: Что-то похожее на разложение пропускаемого света в спектр?

Артем Трилис: Да. Чем больше дальтоны, тем ниже они будут располагаться, так как массовые силы уравновешивают силы электростатического напряжения. Тут тоже очень много вопросов — создание копий любой последовательности нуклеотидов, ДНК, РНК — это не тривиальный процесс, так как нужно знать не только число нуклеотидных пар, но и их порядок. Поэтому это нетривиальная творческая задача для каждого подобного метода. Для каждой ДНК нужно подбирать свой порядок, нередко экспериментировать. Чтобы произвести секвенирование чего-либо, нужно провести очень много манипуляций. Секвенирование генома — это определение порядка нуклеотидной последовательности в ДНК или в РНК.

Если говорить про ПЦР-тест для коронавируса (это вирус, содержащий одноцепочечную РНК в качестве генома). То правильно было бы это называть не просто ПЦР-тест, а RT ПЦР-тест. RT (Reverse Transcription) — это обратная транскрипция, процесс, из которого с помощью специального фермента, который называется обратной транскриптазой, из РНК получается ДНК. А прямой процесс, когда из ДНК получается РНК, называется транскрипцией. То есть для коронавируса сначала нужно сделать обратную транскрипцию (из РНК сделать ДНК) и только потом подключать ПЦР.

ИА Красная Весна : Затратна ли обратная транскрипция при ее проведении в лаборатории?

Артем Трилис: Она не затратна в плане технической организации процесса. Но это дополнительная стадия и ее нужно контролировать.

Теперь по поводу ПЦР тестирования. Кэри Муллис — изобретатель ПЦР тестирования на наличие, в том числе, вирусных частиц, часто выступал и подчеркивал, что сам по себе положительный результат ПЦР-теста нельзя считать медицинским диагнозом. Кстати, он неожиданно скончался в августе 2019 года, незадолго до начала эпопеи с коронавирусом. Но это отдельная тема для беседы.

Потом, после смерти Муллиса, в разгар эпопеи с коронавирусом, когда начали массово применять ПЦР-тесты и ставить на их основе диагнозы, его коллеги и единомышленники много выступали и писали о том, что нельзя ПЦР-тесты считать диагнозом. Если у человека положительный ПЦР-тест, то нельзя считать, что он болен или заразился.

Как мы знаем из физики: любой тест или метод измерения нужно калибровать (устанавливать зависимость между показаниями тест-системы и размером измеряемой величины). А как эти тесты калибруются, никто не знает.

ИА Красная Весна: Что нужно сделать, чтобы откалибровать ПЦР-тест?

Артем Трилис: Во-первых, нужен стандарт — четко выделенный вирус, конкретная ДНК-матрица, по которой будут тестировать. Конкретная последовательность РНК, какие там нуклеотиды и в каком порядке. Я, к сожалению, не нашел в открытой литературе информации о такой полностью проделанной работе.

Знаю только то, что когда геном ковида секвенировали, то собрали некие последовательности из многих кусков — контигов. Потом сверили полученное с базой данных вирусов при помощи компьютерной симуляции. В результате установили, что имеется в наиболее высокой концентрации самая длинная последовательность примерно из 30 тыс. нуклеотидов, на 89,1% совпадающая с последовательностями группы SARS-подобных коронавирусов (род Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus), которые ранее были обнаружены у летучих мышей в Китае.

И на этом основании ученые сделали вывод, что это какой-то новый коронавирус (ссылка на основополагающую работу: Wu F., Zhao S., Yu B., Yan-Mei Chen, Wang W., Zhi-Gang Song, Hu Y., Zhao-Wu Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, Jiao-Jiao Zheng, Lin Xu, Edward C Holmes, Yong-Zhen Zhang. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. // Nature.2020. Mar. T. 579. № 7798. P. 265-269. DOI: 10.1038/s41586-020-2008-3. [PMID: 32015508]). То есть, с моей точки зрения, более-менее адекватного секвенирования не было произведено.

На данный момент лично я считаю, что у нас даже нет оснований утверждать, что это какой-то новый коронавирус. А чем он отличается от SARS-CoV-1 (вспышка на территории РФ была в 2003 году)? А от коронавируса MERS (ближневосточный респираторный коронавирусный синдром) и от других?

Конечно, мы можем ПЦР-тест настроить на определение только S-белка, нам не обязательна вся последовательность. Но ведь и там расшифровано только на 89,1%.

Читайте также: Шведские ученые: белок-шип коронавируса препятствует восстановлению ДНК

Далее по технологии ПЦР-тестирования нужно установить пороговые значения. Как правило, тест не работает только на «да» или «нет». Там есть некая шкала — выше некоторого значения, значит вирус есть, а ниже этого значения — нет. Нужно настраивать, сколько, например, копий ДНК сделать (количество амплификаций).

Как правильно порезать исходную ДНК или РНК, чтобы легче было проводить ПЦР-тест. Сколько делать амплификаций (циклов). Ведь дело в том, что если ты сделаешь больше циклов — то тест будет положительный, потому что есть пороговые значения. Более того, ПЦР-тест — это очень точный тест, он может от одной молекулы-цепочки или даже «обломка» уже дать положительный результат.

К примеру, если просто носом поймать частицу, но не заболеть, и взять в этот момент мазок, то результат теста с высокой вероятностью может быть положительным. В дальнейшем слизистая носа может справиться вирусом, вы можете чихнуть, частицы вылетят и вирусной нагрузки на организм не случится. Вирус не успеет размножиться до того уровня, когда иммунная система перестает справляться. В общем, очень много вопросов к калибровке ПЦР-тестов на всех стадиях.

ИА Красная Весна: В США изготавливают свои тесты, где-нибудь в ЮАР свои. А наши где изготавливаются?

Артем Трилис: Технология все равно везде одинаковая. С точки зрения фундаментального процесса — везде одно и то же, а вот с точки зрения реализации — я не знаю. Очень много параметров может варьироваться. Например, температура отжига на подложке. Очень много информации сейчас в СМИ, выступают ученые и рассказывают про ложноположительные и ложноотрицательные результаты. И очень высокие показатели в этом у ПЦР-тестов. Я сейчас обсуждал только методику, что при ее использовании можно получить неправильный результат, или даже заведомо нужный тебе результат. Я уже не говорю о том, как правильно брать материалы для этого ПЦР-теста, если материалы неправильно взять, то результат также будет не тот, который есть в действительности.

Например, если обильно попить воды перед тестом, то вся слизистая будет промыта и результат будет отрицательный. Даже если я болен и выделяю вирус в окружающую среду, можно сделать так, что тест будет заведомо отрицательный.

Я в прошлом году смотрел инструкции и сертификаты к тестам, там прямо написано, что это «антиген-неспецифические» тесты к коронавирусам. Это значит, что с их помощью нельзя выявить штамм вируса альфа, бета или еще какой-нибудь. Реагенты для теста неспецифические, потому что для создания специфического, на мой взгляд, нужно очень серьезную работу проводить.

ИА Красная Весна: А как это должно работать, чтобы, например, выявить конкретно Омикрон?

Артем Трилис: Нужно знать, чем он отличается от альфы, от дельты. Если, как утверждается, мутации в двух нуклеотидах, то при запуске теста у него должна быть очень тонкая настройка, чтобы это увидеть. Важно знать не только какие нуклеотиды поменялись, но важен и порядок, где это произошло.

Вот недавно видел в объявлениях, что где то в лабораториях нечто подобное делают — при тестировании могут указать, какой конкретно штамм нашли. Но вопрос в том, что там сам «золотой стандарт» изначально неизвестен. Поэтому все это условности.

ИА Красная Весна: Может ли ПЦР-тест перепутать обычный ОРВИ или грипп с коронавирусом?

Артем Трилис: Если в лаборатории все настроено грамотно, то не перепутает. Но бывает такое, что эти тесты выявляют коронавирус в машинном масле, в яблонях, где угодно. Бывает и такое.

ИА Красная Весна: Почему Муллис говорил о том, что нельзя на основе ПЦР-тестов ставить диагноз?

Артем Трилис: Даже если тест настроен правильно, если есть золотой стандарт, мазок взят правильно, то у человека необязательно будет заболевание. Дело в том, что любая болезнь классифицируется не по возбудителю, а по симптоматике. По так называемой нозологии, этиологии. По четко выраженным симптомам, развитию процесса во времени. И если даже тест оказался положительным, то человек может не заболеть, хотя и будет носителем. Термин «бессимптомный больной» придуман неграмотными чиновниками, есть «бессимптомный носитель». А у вас после положительного теста, по сути, начинается другая судьба. Поэтому Муллис выступал против обособленного применения ПЦР-тестов для постановки диагноза, это относится к любому тесту, не только на коронавирус.

ИА Красная Весна: Подобная практика определения диагноза лишь по ПЦР-тестам ненаучна?

Артем Трилис: Именно так. И этому есть практическое подтверждение. Вот сейчас началась Олимпиада, там постоянно тестируют спортсменов. В НХЛ (Национальная хоккейная лига) постоянно проводят тесты, у них жесткие протоколы для спортсменов. Человек получает первый тест положительный, потом повторный сомнительный, а затем третий отрицательный. Или наоборот. Происходит такая чехарда. Уже видно, что что-то не так.

Я согласен с Муллисом и другими врачами, которые предлагают ставить диагноз с учетом тестов правильным образом. Брать ПЦР-тест нужно, как минимум, только тогда, когда есть симптомы заболевания, а не поголовно у всех. А при поголовном тестировании получаются недостоверные данные, которыми вдобавок можно манипулировать и нагнетать истерию.

Вопрос сейчас в том, как отделять статистику по бессимптомным носителям от реально заболевших? Если наблюдается, что чем больше сделано тестов, тем больше показано заболевших, то со статистикой явно что-то не то.

ИА Красная Весна: На это высокопоставленные чиновники говорят, что других вариантов ставить диагноз, кроме тестов, нет.

Артем Трилис: Как нет, есть такой вариант — обсервация (комплекс ограничительных и противоэпидемических мероприятий, направленных на локализацию и ликвидацию очага инфекционных заболеваний). Тестирование — это вспомогательный вариант, а не основной метод. А для начала человек осматривается врачом, собирается анамнез (совокупность сведений, получаемых при медицинском обследовании). Потом можно делать комплексное обследование, тест на антитела, например. Если есть симптоматика заболевания, то какие-то антитела точно будут. Вообще, чехарда с массовым ПЦР-тестированием и возведение его в ранг единственного источника анализа эпидемиологической ситуации — это для эпидемиологии и медицины в целом ситуация уникальная.

Раньше регулярно случались настоящие эпидемии — и ОРВИ с гриппом, и всякими лихорадками типа Эболы — были варианты. А для коронавирусной эпидемии, и то только на бумаге, якобы нет других вариантов, кроме ПЦР-теста… это как минимум странно.

Еще в 2020 году, когда началась истерия с масочным режимом, ВОЗ выпустила рекомендации, их можно найти в интернете на сайте организации, что бессимптомные носители вируса — у них нет такой вирусной нагрузки и они столько вируса не выделяют в окружающую среду, сколько действительно больной. Поэтому для бессимптомников маски не нужны, при этом бессимптомных носителей примерно 80% от протестированных. Эти рекомендации, естественно, все проигнорировали, потому что уж очень понравилось продавать маски.

Продолжение следует…

Свежие статьи